LA DETERMINAZIONE DEL SESSO

Introduzione

La determinazione del sesso nelle varie specie può avvenire con molteplici meccanismi. In alcune specie i due sessi hanno identico corredo genetico, e spetta a segnali ambientali il controllo dello sviluppo fenotipico sessuale (ESD, Environmental Sex Determination). Ad esempio, in alcuni pesci il fenotipo sessuale può variare nell'adulto ed è controllato da un insieme di fattori dinamici che includono segnali ormonali e visivi. In molti rettili (alligatori e tartarughe) il fenotipo sessuale dipende dalla temperatura di incubazione dell'embrione].
In altre specie, il differente corredo cromosomico dei due sessi fornisce un mezzo intrinseco per la determinazione del sesso. In questo caso la determinazione del sesso è di tipo genetico e può essere controllata mediante due diversi meccanismi: il meccanismo dosaggio-dipendente (DSD, Dosage-dependent Sex Determination) e quello basato sulla presenza di un gene dominante (GSD, Genetic Sex Determination). Sia Drosophila che Caenorabditis elegans presentano un meccanismo di determinazione del sesso del tipo dosaggio-dipendente: lo sviluppo dei caratteri sessuali è controllato dal rapporto tra i cromosomi sessuali X e gli autosomi. Infatti, nonostante Drosophila presenti un cromosoma Y nel maschio, esso è irrilevante ai fini della determinazione del sesso, poiché individui XO sono maschi e individui XXY sono femmine.
Nel 1959 fu invece dimostrato che nei Mammiferi la determinazione del sesso non segue un meccanismo a gene dominante come in Drosophila, le femmine hanno due cromosomi X, mentre i maschi hanno un cromosoma X ed uno Y; ma nei mammiferi individui XXY sono maschi, mentre individui XO sono femmine, a dimostrare che il cromosoma Y contiene uno o più fattori determinanti per lo sviluppo del fenotipo sessuale maschile e che invece il rapporto tra cromosomi X e autosomi non è determinante.
Lo sviluppo sessuale nei Mammiferi può essere suddiviso in tre fasi:
1. al momento della fecondazione il cromosoma sessuale (X o Y) presente nello spermatozoo che feconda l'oocita determina il sesso genetico dell'embrione;
2. durante lo sviluppo embrionale la differenziazione del testicolo o dell'ovario a partire dalla gonade bipotenziale è determinata dall'espressione di un gene dominante sul cromosoma Y (sviluppo del testicolo) o dalla sua assenza (sviluppo dell'ovario);
3. le secrezioni ormonali delle gonadi determinano lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari.
Le gonadi producono infatti degli ormoni capaci di regolare lo sviluppo dei caratteri sessuali secondari sia a livello fetale che nell'adulto (pubertà). Quindi altri e numerosi fattori intervengono nella acquisizione del fenotipo sessuale: gli ormoni prodotti dalle cellule endocrine delle gonadi, i fattori che ne regolano la produzione o le successive modificazioni metaboliche, i recettori sulle cellule bersaglio, ecc.
L'acquisizione del fenotipo sessuale è quindi un processo complesso caratterizzato da una precisa sequenza di eventi che si succedono durante lo sviluppo embrionale e che si completano nella pubertà. Lo studio delle alterazioni che possono intervernire ai vari livelli di questo processo consente di definirne le tappe e di individuare i fattori che intervengono nei vari passaggi.
Per molti aspetti lo studio dei processi di sviluppo e differenziamento si è avvalso delle informazioni ottenute dagli invertebrati. I meccanismi della determinazione e del differenziamento sessuale in Drosophila e Caenorabditis elegans sono stati elucidati dettagliatamente anche a livello molecolare. In entrambi gli organismi, i geni coinvolti nel meccanismo dosaggio-dipendente sono noti, ed è nota l'azione delle proteine che essi codificano; ma non vi è alcuna omologia né tra questi due sistemi, né tra loro e alcuno degli elementi del meccanismo di determinazione del sesso finora individuati nei vertebrati. Ciò suggerisce che i meccanismi per la determinazione del sesso si siano evoluti indipendentemente nei vertebrati e negli invertebrati.
D'altro canto la struttura delle gonadi è simile in molti vertebrati, suggerendo che i meccanismi di base per la formazione di testicoli e ovari siano conservati. Si può allora ipotizzare che siano i meccanismi a monte del differenziamento sessuale ad aver subito un'evoluzione diversa nelle varie specie, adattandosi alle differenti condizioni che caratterizzano l'ambiente di sviluppo dell'embrione: un programma di differenziamento sostanzialmente simile sarebbe quindi attivato da stimoli di natura diversa. I pesci e gli altri animali acquatici possono contare sulla diffusione di sostanze chimiche e beneficiare della possibilità di cambiare sesso durante la vita adulta per ottimizzare la soppravvivenza del gruppo. Nelle lucertole e nelle tartarughe l'interazione tra la temperatura e il genoma nella determinazione del sesso è stata ben documentata. Alcuni biologi evoluzionisti suggeriscono che l' "interruttore" genetico sul cromosoma Y dei Mammiferi sia stato sovrapposto su sistemi più antichi per la determinazione del sesso basati sulla temperatura e sugli ormoni. Lo sviluppo intrauterino, che caratterizza l'embrione dei Mammiferi, non consente infatti di utilizzare i fattori ambientali, come la temperatura, quali discriminanti nel differenziamento sessuale, essendo essi rigidamente controllati; inoltre l'embrione è sempre a contatto con gli ormoni materni, il che esclude anche la possibilità di utilizzare meccanismi di tipo ormonale, almeno nella forma che caratterizza lo sviluppo dei rettili.
L'ambiente ormonale femminile che caratterizza l'utero materno potrebbe spiegare perché la via di base dello sviluppo embrionale nei mammiferi sia quella femminile. Nel 1947 Jost dimostrò che la rimozione delle gonadi durante lo sviluppo embrionale del coniglio risultava nella differenziazione del fenotipo sessuale femminile, indipendentemente dal sesso cromosomico dell'embrione. Il lavoro di Jost ha portato quindi a considerare quella femminile come la via predefinita dello sviluppo del fenotipo sessuale, avendo egli dimostrato che la presenza del testicolo è necessaria allo sviluppo dei caratteri sessuali maschili, mentre l'ovario non svolgerebbe un ruolo critico.
Ciò potrebbe far concludere che lo sviluppo dei caratteri sessuali femminili sia un processo automatico e passivo dell'embrione, che avviene spontaneamente in assenza del testicolo: gli ormoni prodotti dal testicolo in formazione sono responsabili del differenziamento del tratto urogenitale e di tutti i caratteri sessuali secondari maschili. In assenza del gene dominante sul cromosoma Y, viene invece attuato un programma genetico di base che porta allo sviluppo dell'ovario a partire dalla gonade bipotenziale e alla conseguente acquisizione dei caratteri sessuali secondari femminili. Finora non sono stati individuati geni determinanti per la formazione dell'ovario, nonostante essi debbano esistere. Alcuni ricercatori ritengono che il gene che determina il sesso maschile possa fungere anche da repressore dello sviluppo femminile ma il "puzzle" della determinazione del sesso nei Mammiferi è lontano dall'essere risolto.

LO SVILUPPO DEGLI ORGANI RIPRODUTTIVI
Bibliografia: B. I. Balinsky (1975) "Introduzione alla Embriologia", Sec. ed. italiana, Zanichelli - K. L. Moore (1980) "Lo Sviluppo dell'Uomo", Zanichelli

Le gonadi indifferenziate
Nei Vertebrati le gonadi si sviluppano dal margine superiore del foglietto viscerale del mesoderma della piastra laterale, nell'ambito delle creste urogenitali, strutture embrionali costituite da due ispessimenti del mesoderma che riveste la cavità celomatica, situati ai lati del mesentere dorsale. Il primo abbozzo della gonade, la cresta genitale, è rappresentato da un'area ispessita dell'epitelio celomatico che si sviluppa sulla faccia mediale della cresta urogenitale, mentre la porzione laterale darà origine al mesonefro.
Ogni cresta è costituita in massima parte da cellule epiteliali inizialmente simili alle altre cellule dell'epitelio peritoneale, ma che diventano cilindriche nei primi stadi di sviluppo. La successiva proliferazione determina la protrusione della cresta nella cavità celomatica, accompagnata dall'assottigliamento della regione che collega la gonade al peritoneo. Infine la gonade resta sospesa nella cavità peritoneale mediante una struttura formata da due foglietti peritoneali e che prende il nome di mesorchio (nel maschio) o di mesovario (nella femmina).
Tra le cellule epiteliali cilindriche si osserva un secondo tipo cellulare, le cellule germinali primordiali o protogoni. Esse appaiono molto più grandi delle cellule epiteliali mesodermiche, sono sferoidali e presentano un grosso nucleo. I protogoni daranno origine ai gameti (oociti e spermatozoi), mentre le cellule epiteliali si differenzieranno nelle cellule somatiche della gonade: cellule del Sertoli e di Leydig nel maschio e cellule follicolari e dell'epitelio superficiale ovarico nella femmina.
I protogoni compaiono nell'embrione in regioni diverse dalle creste genitali, e raggiungono questa sede in seguito a un processo di migrazione. Nell'uomo, all'inizio della quarta settimana, le cellule germinali primordiali sono visibili fra le cellule endodermiche della parete del sacco vitellino. Durante il processo di sollevamento dell'embrione, parte del sacco vitellino viene incorporata, e le cellule germinali primordiali migrano lungo il mesentere dorsale dell'intestino posteriore fino a raggiungere le creste genitali.

Differenziazione delle gonadi
Dopo aver raggiunto le creste genitali, i protogoni si insinuano tra le cellule epiteliali. Nello stesso tempo l'epitelio delle creste si ispessisce e la cresta sporge nella cavità celomatica, lasciando nella parte dorsale una cavità che si riempie di mesenchima indifferenziato. Successivamente migrano in questa regione cellule provenienti dal vicino abbozzo del mesonefro, formando cordoni compatti che prendono il nome di cordoni sessuali primari. A questo punto nella gonade in differenziamento si distinguono uno strato epiteliale superficiale, detto cortex, che contiene anche i protogoni, e una regione interna detta medulla, costituita dai cordoni sessuali primari immersi nel mesenchima in cui si formeranno i vasi sanguigni.
Fino a questo stadio del differenziamento (settima settimana nell'uomo), non vi è alcuna distinzione tra gonade maschile e gonade femminile: solo quando inizia il differenziamento istologico si ha la divergenza tra lo sviluppo del testicolo e quello dell'ovario.

Sviluppo del testicolo
Negli embrioni di sesso maschile i protogoni migrano dal cortex della gonade verso i cordoni sessuali primari della medulla, che assumono l'aspetto di strutture cave e si trasformano nei tubuli seminiferi. I protogoni danno origine agli spermatogoni e poi agli spermatozoi, mentre le cellule dei cordoni sessuali primari danno origine alle cellule del Sertoli. Nella parte dorsale della gonade si sviluppa un sistema di tubuli molto sottili che darà origine alla rete testis. I canali della rete testis entrano in connessione con i tubuli seminiferi e con gli adiacenti tubuli del mesonefro, stabilendo così, attraverso il mesonefro, un collegamento con il dotto di Wolff, che dà origine alle strutture per l'emissione degli spermatozoi: dotto deferente, epididimo, vescichetta seminale.
La medulla diviene quindi la parte funzionale del testicolo, mentre il cortex si riduce trasformandosi in un sottile strato epiteliale che riveste la superficie del testicolo rivolta verso la cavità celomatica.

Sviluppo dell'ovario
Negli embrioni di sesso femminile la medulla si riduce, i cordoni sessuali primari si riassorbono e la parte interna della gonade si riempie di mesenchima lasso permeato di vasi sanguigni. Le cellule germinali primordiali restano nel cortex, che si ispessisce notevolmente. Durante l'accrescimento del cortex, le cellule epiteliali si organizzano in cordoni che circondano una o più cellule germinali, costituendo i follicoli, mentre gli oociti entrano negli stadi iniziali dell'oogenesi.
Il destino dei protogoni non è intrinsecamente stabilito, come dimostra la possibilità di indurre reversioni sessuali: l'evento decisivo è rappresentato dalla migrazione nella medulla, che porta irrimediabilmente allo sviluppo degli spermatozoi, mentre la permanenza nel cortex determina lo sviluppo degli oociti.

DIFFERENZIAZIONE DEI DOTTI GENITALI

I dotti genitali (o gonodotti) sono le strutture attraverso le quali i gameti vengono portati all'esterno o comunque nel sito dove avverrà la fecondazione.
Due paia di gonodotti si sviluppano in entrambi i sessi: i dotti mesonefrici o di Wolff e i dotti paramesonefrici o di Müller. Quando la gonade bipotenziale inizia il suo differenziamento, una delle due strutture degenera, mentre l'altra evolve nei gonodotti propri del sesso dell'embrione.
I dotti mesonefrici si formano nella regione latero-dorsale della cresta urogenitale e decorrono longitudinalmente lungo il mesonefro, verso il quale proiettano i tubuli mesonefrici, a decorso trasversale. All'estremità craniale i dotti di Wolff terminano nel mesonefro, mentre a quella caudale penetrano nel seno urogenitale (l'abbozzo della vescica), che si apre all'esterno.
I dotti di Wolff sono già apprezzabili quando la cresta genitale comincia a formarsi come ispessimento mediale delle creste urogenitali e prima che cominci la migrazione delle cellule germinali primordiali. Più tardi (quinta settimana nell'uomo) cominciano a formarsi i dotti di Müller, come invaginazioni longitudinali dell'epitelio celomatico che decorrono lungo le creste urogentali in posizione latero-ventrale rispetto ai dotti di Wolff. La migrazione dei protogoni è già in atto e sono già visibili i cordoni sessuali primari quando gli abbozzi dei dotti paramesonefrici si chiudono formando i canali di Müller (sesta settimana nell'uomo). L'estremità craniale imbutiforme dei dotti di Müller si apre nella cavità celomatica o peritoneale, e i dotti si estendono caudalmente decorrendo paralleli ai dotti mesonefrici. Nella regione caudale incrociano ventralmente i dotti di Wolff e si incontrano tra loro sulla linea mediana fondendosi nell'abbozzo uterovaginale, che non si apre all'esterno ma termina sulla parete dorsale del seno urogenitale, dove forma un rilievo detto tubercolo di Müller.

Sviluppo dei gonodotti maschili
Quando i testicoli fetali sono differenziati, cominciano a produrre ormoni che determinano lo sviluppo dei dotti di Wolff e la degenerazione dei dotti di Müller. Nello stesso tempo anche il mesonefro, che è una struttura embrionale, degenera, e alcuni tubuli mesonefrici partecipano alla formazione dei gonodotti, differenziandosi nei dotticini efferenti, che si connettono alla rete testis da un lato e si aprono nel dotto mesonefrico dall'altro. Questo tratto del dotto mesonefrico dà luogo all'epididimo, mentre il tratto successivo acquista uno spesso rivestimento di tessuto muscolare liscio e diventa il dotto deferente. Nella porzione caudale, un'evaginazione laterale del dotto di Wolff dà origine alla vescichetta seminale, mentre la restante porzione prende il nome di dotto eiaculatore, che distalmente confluisce insieme al dotto controlaterale nell'uretra, che costituisce la parte terminale delle vie urinarie.

Sviluppo dei gonodotti femminili
Nelle femmine, la presenza degli ovari induce la regressione dei dotti di Wolff e lo sviluppo dei dotti di Müller, dai quali avranno origine gli ovidutti (Tube di Falloppio). Nella parte craniale le aperture imbutiformi danno origine alle trombe uterine, mentre, nella parte caudale, dall'abbozzo uterovaginale si formeranno l'utero e la vagina, che acquista un'apertura all'esterno distinta da quella delle vie urinarie.
Il progressivo sviluppo dei dotti genitali caratteristici del sesso dell'embrione e la regressione dei dotti del sesso opposto sono dovuti all'azione degli ormoni sessuali, la cui secrezione da parte delle gonadi comincia quando esse passano dallo stato indifferenziato a quello differenziato di testicoli o ovari. Infatti, iniettando ormoni sessuali in embrioni sia di Uccelli che di Mammiferi, si può indurre lo sviluppo dei gonodotti del sesso opposto: l'iniezione di ormoni femminili in embrioni maschili provoca la permanenza e l'ipertrofia dei dotti di Müller, mentre l'iniezione di ormoni maschili in embrioni di sesso femminile provoca la regressione quasi totale dei dotti di Müller e un'ipertrofia dei dotti di Wolff.
Altri dati interessanti riguardano l'effetto dell'asportazione delle gonadi in giovani embrioni (castrazione): mentre negli Uccelli la castrazione di embrioni che non hanno ancora sviluppato i caratteri sessuali secondari porta a un fenotipo ambiguo con permanenza di entrambi i tipi di dotti, nei Mammiferi embrioni castrati di entrambi i sessi tendono a svilupparsi secondo lo schema femminile, con progressivo sviluppo dei dotti di Müller e degenerazione dei dotti di Wolff. Ciò suggerisce che nei Mammiferi l'ormone sessuale maschile è il principale responsabile, con la sua presenza o con la sua assenza, dello sviluppo dei caratteri sessuali secondari. Secondo alcuni autori ciò si spiegherebbe con il fatto che, sviluppandosi nell'utero, l'embrione di Mammifero è comunque 'immerso' in ormoni femminili, e quindi non ha bisogno di ulteriori stimoli per svilupparsi in senso femminile.

PARTE II

LA DETERMINAZIONE DEL SESSO

I cromosomi sessuali
La nozione primaria su cui si basa storicamente lo studio della determinazione del sesso è il differente corredo cromosomico che caratterizza i due sessi. Negli animali, infatti, il sesso è frequentemente associato con una coppia di cromosomi che mostra caratteristiche differenti nel maschio e nella femmina. Questi cromosomi sono detti cromosomi sessuali, e costituiscono una coppia perché durante la meiosi si appaiano comportandosi da omologhi, ma possono essere morfologicamente differenti tra loro in uno dei due sessi (sesso eterogametico). Gli altri cromosomi non associati al sesso sono detti autosomi. Nella maggior parte dei Mammiferi (incluso l'uomo) i maschi sono portatori di una coppia eteromorfica di cromosomi sessuali (XY), mentre le femmine hanno due cromosomi sessuali identici (XX).
Esistono però anche sistemi differenti. Negli Uccelli, nei serpenti, ed in vari invertebrati, come i Lepidotteri, il sesso eterogametico è quello femminile. Per distinguere questa situazione da quella dei Mammiferi (XX - XY), negli Uccelli i cromosomi sessuali vengono indicati con le lettere Z e W, con le femmine ZW e i maschi ZZ

I cromosomi sessuali X e Y sono differenti per dimensioni e forma (la loro denominazione fa infatti riferimento all'aspetto che assumono in meiosi, che li rende simili rispettivamente a una x e a una y), e ciò riflette il differente contenuto genetico: il cromosoma Y è molto più piccolo, e possiede geni meno numerosi e differenti da quelli portati dal cromosoma X. L'osservazione che nei Mammiferi la mancanza del cromosoma Y (XO) porta allo sviluppo di caratteri sessuali femminili ha portato alla conclusione che il cromosoma Y è portatore di un gene dominante necessario affinché lo sviluppo dell'embrione evolva verso il sesso maschile e che invece lo sviluppo di un embrione di sesso femminile non richieda particolari fattori.

La genetica della determinazione del sesso
Il gene della determinazione del sesso: Sry
Sin dal 1959 è noto che nei mammiferi il cromosoma Y contiene un gene determinante per lo sviluppo del testicolo e quindi per il differenziamento del fenotipo sessuale. In seguito, mediante lo studio del fenotipo risultante da vari tipi di riarrangiamenti cromosomici, è stato possibile circoscrivere la minima porzione del cromosoma Y necessaria per il differenziamento del testicolo (sex-determining region ). Nel 1990 il gene che codifica per il fattore determinante lo sviluppo del testicolo è stato isolato nell'uomo e nel topo. Il gene umano è stato chiamato SRY (sex-determining region of the Y chromosome), mentre per convenzione nel topo e negli altri animali esso è indicato come Sry*. Questo gene è stato trovato in tutti i mammiferi finora esaminati, e si presenta molto conservato. Sry è necessario e sufficiente per attivare il differenziamento maschile. Infatti mutazioni di questo gene nell'uomo o la sua delezione nel topo determinano sviluppo del fenotipo sessuale femminile in individui XY. Viceversa la presenza di Sry in topi transgenici XX porta allo sviluppo dei testicoli e alla completa inversione di sesso. Molti autori ritengono che l'espressione di Sry in embrioni XY interrompa lo sviluppo in senso femminile e inizi quello in senso maschile, in modo che se Sry non è espresso lo sviluppo continua secondo la linea femminile.
Sry è l'unico gene del cromosoma Y necessario e sufficiente per attivare il differenziamento del fenotipo maschile. Esso agisce da interruttore molecolare e, in questo senso, è considerato il gene della determinazione del sesso nei Mammiferi. Ma è chiaro che esistono molti geni necessari per l'attuazione dei programmi di differenziamento sia maschile che femminile. Il lavoro svolto da numerosi ricercatori negli ultimi anni è pertanto incentrato soprattutto su Sry, la sua espressione e la sua funzione nella determinazione del sesso, ma cominciano a emergere dati su altri geni coinvolti nello sviluppo dei caratteri sessuali.

ESPRESSIONE DI SRY
Nel topo il gene Sry è espresso sia nell'embrione che nell'adulto: nel corso dello sviluppo embrionale esso è trascritto nella porzione genitale delle creste urogenitali (trascritto ugr) durante una ristretta finestra temporale che va da 10.5 a 12 giorni post-coitum (dpc), cioè subito prima che la divergenza tra ovario e testicolo si manifesti, come dimostrato da esperimenti di ibridazione in situ, PCR e RNase protection (a causa del basso livello di espressione di Sry, il trascritto non è rivelabile con Northern blot). Sry è trascritto anche nei testicoli dell'adulto e in altri tessuti eterologhi, ma con caratteristiche diverse rispetto all'espressione osservata nell'embrione: il trascritto embrionale inizia in corrispondenza di uno specifico promotore e include una sequenza non tradotta di 3.5 kilobasi al 3' assente nei trascritti dell'adulto. Inoltre nell'adulto il trascritto è circolare, e probabilmente risulta dal cleavage di un trascritto primario più grande, presente a livelli molto bassi. Il trascritto primario è più esteso del trascritto ugr, iniziando più di 1000 basi a monte, e continuando oltre il sito di poliadenilazione del trascritto ugr.
Il gene Sry è fiancheggiato da due grandi ripetizioni invertite che si estendono per più di 15 kb da entrambi i lati della regione codificante. Il lungo trascritto primario trovato nel testicolo di topi adulti contiene sequenze omologhe a queste ripetizioni invertite, lasciando supporre la possibilità di strutture secondarie capaci di dare in seguito a splicing il trascritto circolare. E' stato dimostrato sperimentalmente che frammenti di 400 basi delle ripetizioni invertite sono sufficienti a indurre la circolarizzazione del trascritto primario di Sry in cellule COS trasfettate.
Il trascritto circolare tipico del testicolo del topo adulto non viene tradotto, probabilmente per l'impossibilità di realizzare complessi con i polisomi, e la sua funzione non è ancora stata chiarita. L'impossibilità della traduzione rende il trascritto inattivo, e pertanto la circolarizzazione del trascritto di Sry nel topo adulto potrebbe essere un modo per disattivare il gene, e quindi far parte di un meccanismo regolatorio. Nell'uomo il gene SRY non è fiancheggiato da ripetizioni invertite, e il trascritto circolare non è stato osservato nell'uomo né in altri mammiferi. Allora se la circolarizzazione osservata nel topo è un mezzo per disattivare il gene, nell'uomo devono esistere altri meccanismi capaci di sortire il medesimo effetto.
L'analisi genetica non ha permesso di assegnare alcuna funzione al trascritto circolare. Esso è espresso soprattutto nelle cellule germinali del testicolo dell'adulto, ma nessun effetto sullo sviluppo degli spermatozoi è stato osservato nei mutanti.
Il trascritto ugr manca al 5' di gran parte della ripetizione invertita necessaria per la circolarizzazione, e infatti nella gonade fetale non è stato osservato trascritto circolare. Studi di RNase protection hanno individuato una regione non tradotta di 3.5 kb al 3' del trascritto ugr di topo (UTR, untraslated region), che verosimilmente ha funzione regolatoria. E' probabile che la UTR sia coinvolta nel controllo post-trascrizionale (stabilità, splicing, traduzione).
La regolazione di Sry richiede con tutta probabilità la partecipazione di altre proteine. Per lo studio in vitro della regolazione di Sry e dell'interazione con altre proteine è stata creata una linea cellulare derivata dalla cresta genitale di topo.
Poiché il tessuto fetale umano non è facilmente disponibile, l'analisi del trascritto SRY umano è basata soprattutto sul trascritto del testicolo dell'adulto e sui trascritti da cellule eterologhe in coltura. Non è noto pertanto se e come il trascritto fetale umano differisca da quello dell'adulto.
La sequenza codificante (ORF, open reading frame) del trascritto sia murino che umano è costituita da un singolo esone, comune al trascritto ugr e a quello del testicolo, e non vi sono siti di splicing al suo interno. Nell'embrione umano l'espressione di SRY avviene durante un periodo più lungo delle 40 ore che caratterizzano l'espressione di Sry nella cresta genitale murina. Come per il topo, anche nell'uomo e nei marsupiali SRY/Sry è espresso nell'adulto anche in tessuti diversi dal testicolo con significato non ancora chiarito. Nell'uomo alle mutazioni del gene SRY non sono mai stati associati difetti in tessuti diversi dalle gonadi, il che sembrerebbe indicare che SRY non ha alcuna funzione negli altri tessuti che presentano il trascritto. D'altronde, in mancanza dell'anticorpo per la proteina SRY, in nessuna specie è noto fino ad oggi se l'espressione della proteina vada di pari passo con quella del trascritto, e quindi è possibile che i tessuti eterologhi nei quali il trascritto è stato osservato non presentino alcuna proteina SRY, e che anzi la presenza del trascritto sia indice di avvenuta disabilitazione del gene mediante blocco della traduzione.

REGOLAZIONE TRASCRIZIONALE DI SRY
La regolazione del livello del trascritto Sry non è stata ancora ben caratterizzata. In femmine transgeniche Sry viene trascritto normalmente, indicando che eventuali geni necessari per la trascrizione di Sry sono presenti anche nel corredo cromosomico femminile, e cioè non mappano sul cromosoma Y. Sono stati individuati numerosi geni che sembrano agire a monte nel processo di gonadogenesi in entrambi i sessi, ma nessuno di essi è stato direttamente collegato all'attivazione di Sry. I geni Sf1 (steroidogenic factor I), Wt1 (Wilms' tumour gene), Lim1 e Emx2 (due geni homeobox) sono tutti necessari per lo sviluppo della cresta genitale, in quanto topi con mutazioni nulle di tali geni non sviluppano affatto le gonadi. Nei mutanti Sf1-/- avvengono le prime fasi dello sviluppo delle gonadi, ma tra 11.5 e 12.5 dpc le gonadi primordiali regrediscono per apoptosi. In questi mutanti Sry è espresso, indicando che Sf1 non è richiesto per l'attivazione della trascrizione di Sry. Nei mutanti Wt1-/- la cresta genitale inizia a formarsi, ma non si verifica l'ispessimento dell'epitelio celomatico, e a 14.5 dpc non restano tracce della gonade primordiale. La maggior parte degli embrioni Lim1-/- muoiono prima che lo sviluppo delle gonadi abbia inizio ; nei pochi mutanti Lim1-/- che sopravvivono alla nascita mancano sia le gonadi che i reni, e non è noto se per regressione degli abbozzi embrionali o per assenza dell'intero processo di sviluppo. I mutanti Emx2-/- presentano un normale sviluppo delle creste genitali fino a 11.5 dpc, ma in seguito esse regrediscono, probabilmente come risultato di difetti della proliferazione, differenziazione e/o sopravvivenza delle cellule mesonefriche.
Altri studi suggeriscono che il livello di espressione di Sry sia critico per la determinazione del sesso, che quindi sarebbe altamente sensibile ad effetti dose. Ad esempio, in topi mutanti in cui la regione del cromosoma Y situata tra Sry e il centromero viene deleta (Srydel), l'espressione di Sry è più bassa e il fenotipo risultante è la reversione di sesso. Nell'uomo, tra il 10 e il 20% delle femmine XY presentano una mutazione in SRY e, benché le mutazioni de novo risultino sempre nel completo fallimento dello sviluppo del testicolo e nello sviluppo femminile a tutti gli effetti, in alcuni casi il padre è portatore della stessa mutazione presentata dalle figlie XY, il che indica una penetranza variabile della mutazione. Assumendo che, come osservato nel topo, il livello di espressione di SRY sia critico per la determinazione del sesso anche nell'uomo, tale variabilità potrebbe essere il risultato di un diverso grado di influenza del background genetico di ogni individuo sull'espressione di SRY. E' stato trovato un caso di reversione parziale del sesso in associazione con la delezione di una sequenza al 3' della ORF di SRY, il che permette di ipotizzare che tale regione abbia un ruolo nella regolazione della trascrizione di SRY.

LA PROTEINA SRY
Sry codifica per una proteina che presenta un dominio di legame con il DNA di circa 70 amminoacidi caratteristico delle proteine High Mobility Group e perciò chiamato HMG box. Si pensa che la proteina si leghi alle regioni regolatorie di altri geni che intervengono nel differenziamento delle gonadi a valle di Sry, e nei confronti dei quali Sry svolgerebbe dunque la funzione di regolatore trascrizionale. La HMG box di Sry è altamente conservata in tutti i mammiferi in cui è stata sequenziata, e sono state trovate mutazioni di questa regione associate a reversione del sesso (femmine XY), indicando che, con tutta probabilità, la funzione di Sry nella determinazione del sesso passa per la capacità della proteina di legare il DNA. Sono state descritte molte mutazioni della HMG box della proteina SRY umana in femmine XY (oltre ad una localizzata al 5' della ORF ), mentre nessun polimorfismo è stato trovato nel dominio HMG di maschi normali, indicando che la sequenza della HMG box è determinante per lo sviluppo del sesso maschile, e che ogni sua variazione produce alterazioni della proteina le quali, inficiandone la funzione, risultano in reversione del sesso.
Al di fuori del dominio HMG di legame con il DNA, la sequenza di SRY/Sry presenta scarsa omologia tra le specie, sia a livello nucleotidico che a livello amminoacidico. La funzione di SRY deve dunque risiedere nel legame con il DNA di altri geni, nei confronti dei quali SRY potrebbe fungere da attivatore o da repressore. Nella sequenza della proteina murina è presente una regione ricca di glutammina situata al 3' del dominio HMG che sembra essere necessaria per l'attivazione di un gene bersaglio in vitro; la proteina umana non presenta questa regione e non si comporta da attivatore nel medesimo saggio in vitro, suggerendo la possibilità che l'attività della proteina nell'uomo sia perfezionata dal legame con altre proteine, in accordo con l'ipotesi che la proteina SRY possa agire da attivatore o da repressore a seconda del complesso formato al sito di legame con il DNA.
Le regioni di Sry al di fuori del dominio di legame del DNA evolvono rapidamente (non sono conservate) e ciò potrebbe rappresentare il risultato di una selezione adattativa finalizzata all'evoluzione di regioni di interazione con altre proteine, diverse da specie a specie. Alcuni autori hanno addirittura ipotizzato che questa caratteristica del gene Sry abbia un significato specifico nel processo di speciazione, ipotesi confutata da dati recenti che evidenziano la bassa variabilità di queste sequenze tra diverse specie di marsupiali.

I GENI SOX
Lo screening di una libreria di cDNA embrionale di topo (8.5 dpc), usando il dominio HMG di Sry. come sonda, ha consentito di individuare numerosi geni contenenti la HMG box. Questi geni sono stati chiamati SOX (Sry-related HMG box-containing genes), e formano una grande famiglia i cui membri presentano un'omologia >60% nel dominio HMG. Tutti i geni Sox riconoscono e si legano alla medesima sequenza bersaglio di DNA in prove di site-selection in vitro, anche se con differenti gradi di affinità. Queste proteine svolgono probabilmente ruoli altamente specifici in vivo, e la loro specificità può derivare dal differente pattern di espressione nei vari tipi cellulari, dalla localizzazione nucleare delle proteine codificate e dall'interazione di queste con proteine regolatorie.

INTERAZIONE DI SRY E DELLE PROTEINE SOX CON IL DNA
Pur non essendoci ancora evidenze dirette a causa della mancanza dell'anticorpo specifico, la presenza del dominio di legame con il DNA lascia supporre che la proteina SRY si localizzi nel nucleo. Il dominio HMG contiene inoltre un segnale di localizzazione nucleare che, oltre a rafforzare l'ipotesi fatta, può rappresentare un ulteriore livello di regolazione dell'attività di SRY: proteine regolatrici potrebbero infatti legarsi alla sequenza segnale mascherandola e impedendo l'ingresso di SRY nel nucleo. Anche altre proteine della famiglia SOX contengono segnali di localizzazione nucleare. SOX9 è espressa nelle gonadi sia maschili che femminili: nel maschio, subito dopo l'inizio dell'espressione di Sry, SOX9 viene trasportata nel nucleo delle cellule pre-Sertoli, in corrispondenza con l'inizio del loro processo di differenziazione.
Le proteine HMG, originariamente isolate come gruppo eterogeneo di componenti non istonici dei nucleosomi, sono accomunate dalla presenza di un dominio conservato per il legame con il DNA, chiamato, come già detto, HMG box. SRY e le proteine SOX appartengono a un sottogruppo delle proteine HMG, in quanto capaci di instaurare un legame sito-specifico con il DNA. Come altre proteine dotate di questa proprietà, esse si legano al solco minore della doppia elica e mostrano due diverse attività: il legame sequenza-specifico al DNA lineare e il legame sequenza-indipendente alle strutture curvate del DNA cruciforme; il legame di SRY e delle proteine SOX al DNA lineare ne induce la curvatura.
Molti dati indicano che SRY e le proteine SOX agiscono da organizzatori locali di cromatina piuttosto che come attivatori o repressori classici. Si pensa che le proteine HMG svolgano un ruolo architettonico, facilitando l'assemblaggio dei complessi nucleoproteici al sito bersaglio. Studi condotti su un'altra proteina HMG, LEF1, suggeriscono che la curvatura indotta nel DNA possa avvicinare fattori trascrizionali legati al DNA in siti distanti tra loro, risultando nell'attivazione o repressione del gene bersaglio.
Il confronto delle proprietà di legame in vitro di proteine SRY normali e SRY mutanti umane derivate da femmine XY (reversione del sesso) ha evidenziato mutazioni che alterano la capacità della proteina di legare o di curvare il DNA. La capacità di SRY di legare il DNA è necessaria per la formazione del testicolo, in quanto la proteina estratta da pazienti con reversione del sesso (femmine XY) manca di tale attività in vitro.
La modellizzazione molecolare dell'interazione tra SRY e la cromatina ha permesso di identificare amminoacidi importanti per la stabilità strutturale della proteina e altri che si trovano nei punti critici di contatto con il DNA. Molte delle mutazioni individuate in individui XY con reversione del sesso ricadono in una di queste due categorie.

I BERSAGLI DI SRY
Uno dei problemi per l'identificazione dei bersagli di SRY risiede nella mancanza di sistemi di cellule in coltura che possano costituire un modello dell'azione di SRY in cellula. I possibili bersagli di SRY potrebbero essere presenti solo nelle cellule che esprimono SRY in vivo; pertanto indurne l'espressione in sistemi cellulari diversi ma per i quali esistono metodi di coltura in vitro ben caratterizzati potrebbe non portare ad alcuna conclusione. D'altro canto non è ancora disponibile un metodo per coltivare in vitro le cellule che esprimono nativamente Sry.
Un approccio per identificare i geni bersaglio di SRY consiste nell'individuare le divergenze precoci nei pattern di espressione tra le gonadi maschili e quelle femminili. Con questa tecnica, oltre alla differente espressione degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli ormoni steroidei, sono state individuate differenze nell'espressione dei geni Amh, Sf1, Dhh e Bmp8.

Amh è un gene espresso dalle cellule del Sertoli. Esso codifica per l'ormone che determina la regressione dei dotti Müller negli embrioni di sesso maschile (anti-Müllerian hormone, AMH, indicato anche come MIS, Müllerian-inhibiting substance) e costituisce quindi uno dei potenziali bersagli dell'azione di SRY: infatti, il differenziamento del fenotipo sessuale maschile richiede, oltre alla formazione del testicolo, la formazione dei gonodotti maschili a partire dai dotti di Wolff e la contemporanea degenerazione dei precursori dei gonodotti femminili, i dotti di Müller. AMH è responsabile della regressione dei dotti di Müller, mentre il testosterone secreto dalle cellule di Leydig determina lo sviluppo dei dotti di Wolff.
Amh non è necessario per la formazione del testicolo: in topi maschi Amh-/- il testicolo si sviluppa normalmente ma si ha permanenza dei dotti di Müller, il che produce una condizione di pseudoermafroditismo. La maggior parte dei mutanti sono sterili perché lo sviluppo di entrambi i gonodotti impedisce fisicamente l'emissione degli spermatozoi; inoltre molti mutanti Amh-/- mostrano iperplasia delle cellule di Leydig o addirittura tumori. Viceversa femmine transgeniche che esprimono cronicamente Amh durante l'embriogenesi non sviluppano l'utero e gli ovidutti, e le ovaie, benché formate, perdono le cellule germinali e degenerano.
SRY induce l'espressione di AMH, che però sembra non essere un diretto bersaglio del legame di SRY: infatti, benché sequenze che SRY riconosce in vitro siano presenti a monte del promotore di Amh, mutazioni a monte di Amh non influenzano l'attivazione da parte di SRY. Questi risultati apparentemente contraddittori potrebbero essere spiegati ipotizzando che SRY promuova la formazione di un complesso di attivazione che si lega al promotore di Amh, e che esso sia attivo anche quando l'affinità di legame è ridotta dalle mutazioni.
L'ormone AMH secreto dalle cellule di Sertoli deve a sua volta agire su altre cellule bersaglio per indurre la regressione dei dotti di Müller. Mediante saggi di ibridazione in situ, l'espressione di due geni per i putativi recettori di AMH è stata localizzata nelle cellule mesenchimali adiacenti ai dotti di Müller, suggerendo che AMH agisca alterando il mesenchima che circonda i dotti provocandone la regressione con meccanismo indiretto.

Il gene Sf1 codifica per un recettore steroideo nucleare, il fattore steroidogenico I (SF1, Steroidogenic factor I). Esso svolge sicuramente un ruolo nella differenziazione delle gonadi, in quanto la sua espressione nelle gonadi primordiali assume caratteristiche differenti nel maschio e nella femmina a partire da 12.5 dpc, cioè in corrispondenza con la divergenza dello sviluppo del testicolo da quello dell'ovario. Inoltre SF1 agisce a stadi più tardivi dello sviluppo del testicolo nel controllo delle vie di sintesi degli androgeni nelle cellule di Leydig e nell'attivazione di AMH nelle cellule di Sertoli. Gli embrioni Sf1-/- non sviluppano le gonadi, e se ciò da un lato convalida il ruolo primario di Sf1, dall'altro impedisce di esaminare più dettagliatamente il ruolo di SF1 nelle fasi successive dello sviluppo del testicolo.

L'espressione di Dhh (Desert hedgehog) è coinvolta nelle segnalazioni tra le cellule di Sertoli e le cellule germinali mentre Bmp8 è necessario per la regolazione della spermatogenesi. Questi due geni mostrano differenti pattern di espressione nelle gonadi maschili ed in quelle femminili, ma nessuno dei due è necessario per lo sviluppo del testicolo, dato che esso avviene normalmente sia nei topi Dhh-/- che in quelli Bmp8-/-.

ALTRI GENI DELLA DETERMINAZIONE DEL SESSO
Lo studio delle mutazioni naturali associate ad alterazioni dello sviluppo dei caratteri sessuali può consentire di raccogliere ulteriori informazioni per l'individuazione dei geni coinvolti nella determinazione del sesso.
Sia nel topo che nell'uomo sono note numerose mutazioni che influenzano la determinazione del sesso (riassunte nelle Tabelle 1 e 2).

I GENI TDA
La mutazione murina storicamente più importante è detta YPOS: i topi Mus musculus Poschiavinus portatori di questa mutazione non mostrano alcuna alterazione fenotipica; ma quando il cromosoma YPOS, in seguito a incroci, viene ereditato da individui di razze differenti si ha una elevata incidenza di ovotestis, cioè di gonadi ambigue, e di completa reversione del sesso. Il fenomeno si osserva soprattutto nella linea C57BL6. Evidentemente il background genetico autosomico influenza l'attività dei geni del cromosoma Y, e questa particolare mutazione ha permesso quindi di rivelare l'esistenza di loci autosomici coinvolti nella determinazione del sesso. L'effetto YPOS suggerisce che tali loci siano capaci di influenzare l'espressione di Sry, dato che il medesimo gene Sry non produce alterazioni fenotipiche in alcuni individui ma può dare addirittura reversione del sesso in altri. I loci autosomici implicati nella determinazione del sesso, di cui la mutazione YPOS ha consentito di postulare l'esistenza, sono stati chiamati Tda (testis-determining autosomal loci). Tre diverse mutazioni autosomiche associate a reversione del sesso hanno permesso di localizzare 3 geni Tda sui cromosomi 2, 4 e 5 (vedi Tabella 1).
Verosimilmente, dato anche il differente grado di gravità delle alterazioni fenotipiche a carico delle gonadi, l'effetto YPOS è dovuto a interazioni genetiche capaci di influenzare il livello di espressione di Sry. Uno dei loci capaci di tale influenza sembra codificare per una proteina coinvolta nella stabilità del trascritto di Sry.

Tabella 1: mutazioni che influenzano la determinazione del sesso nel topo

mutazione	cromosoma	gene
YPOS	Y	Sry
TOrl(delezione)/YAKR	17/Y	Brachyary(+/-)
Thp(delezione)/YAKR	17/Y	Brachyary(+/-)
W19H,We	5	c-Kit
Sld	10	MglSl-d
Tda1	2 ctr	?
Tda2	4 dist	?
Tda3	5 ctr	?
XYTdym1	Y	Sry
XYdel	Y	?

Tabella 2: mutazioni che influenzano la determinazione del sesso nell'uomo

mutazione	cromosoma	gene
XY gonadal dysgenesis	Y	15% SRY
duplicazione DSS	Xp21	DAX1
displasia campomelica	17q	SOX9
sindrome di Denys-Drash	11p	WT1
sindrome di Frasier	11p	WT1
Delezioni	9pter	?
Delezioni	10qter	?
Short-rib polydactyly type IV	?	?
alfa-talassemia/ritardo mentale X-linked (ATR-X)	Xq13	XH2
Smith-Lemli-Opitz (SLO)	7q32	?

Uno dei geni individuati mediante lo studio di mutazioni umane è SOX9, che codifica, come già detto, per una proteina contenente una HMG box simile a quella di SRY. SOX9 è stato individuato sul braccio lungo del cromosoma 17 clonando il punto di rottura cromosomico delle traslocazioni presenti in pazienti affetti da displasia campomelica, una malattia invalidante delle ossa associata ad un'elevata incidenza di reversione di sesso da maschio a femmina. E' evidente quindi che questo gene, oltre al ruolo nella morfogenesi della ossa, è associato con lo sviluppo del testicolo. A riprova di ciò, nella gonade di embrioni XY l'espressione di questo gene aumenta subito dopo l'inizio dell'espressione di Sry ed è osservata durante la formazione del testicolo non solo nel topo e in altri mammiferi, ma anche nei polli.
Il fatto che pazienti femmine con displasia campomelica non presentino alterazioni nello sviluppo delle gonadi fa pensare che SOX9 agisca insieme a SRY nel determinare lo sviluppo in senso maschile degli embrioni XY, e che SRY e SOX9 possano far parte della stessa sequenza di controllo dello sviluppo embrionale. L'analisi mutazionale di SOX9 nell'uomo ha mostrato che questo gene è aplo-insufficiente: il livello normale di trascritto, e quindi di proteina, è mantenuto solo in presenza di entrambi gli alleli. Mutazioni in un singolo allele possono pertanto produrre un abbassamento del livello di proteina SOX9, e se tali mutazioni sono capaci di provocare gravi turbe dello sviluppo quali la reversione di sesso, allora il dosaggio di SOX9 svolge un ruolo critico per il normale sviluppo degli embrioni maschili.
Sox9 è espresso durante lo sviluppo della cresta genitale negli embrioni di topo, ma non è noto il tipo cellulare in cui l'espressione avviene. Se Sox9 fosse espresso nello stesso tipo cellulare che esprime Sry, forse potrebbe agire aumentando il segnale di Sry al di sopra della soglia critica, e contibuendo così ad innescare lo sviluppo del testicolo. In alternativa, Sox9 potrebbe essere espresso in un tipo cellulare diverso che risponde al segnale di Sry mediante interazioni cellula-cellula.
DSS-DAX1
Un'altra mutazione umana associata a reversione del sesso riguarda una regione del braccio corto del cromosoma X, indicata con Xp21. Se questa regione è duplicata o traslocata su un autosoma, individui XY non sviluppano i testicoli e si ha invece lo sviluppo del fenotipo sessuale femminile. Ciò accade anche in presenza di un normale gene SRY sul cromosoma Y, indicando che la regione Xp21 contiene un gene capace di indurre lo sviluppo femminile indipendentemente dalla presenza del fattore primario per la determinazione del sesso maschile. Il fatto che la reversione del sesso sia associata a duplicazioni o traslocazioni di questa regione indica che l'effetto è dose-dipendente, ed il gene di cui si è postulata l'esistenza è stato pertanto chiamato dosage-sensitive sex-reversal (DSS).
L'inattivazione dei cromosomi X sovrannumerari, che si verifica tanto nelle femmine quanto negli individui portatori di aberrazioni cromosomiche, impedisce qualsiasi effetto dose da parte di geni situati sul cromosoma X, assicurando che le cellule con più di un cromosoma X producano comunque la dose di trascritto corrispondente ad un unico allele: gli embrioni XXY, pur avendo due cromosomi X, e quindi anche due geni DSS, si sviluppano come maschi, perché uno dei due geni DSS è inattivato e il gene SRY svolge un ruolo dominante nell'indurre lo sviluppo del testicolo. Invece, sia la duplicazione che la traslocazione su un autosoma fanno sì che DSS sfugga a questo meccanismo di controllo, portando ad un dosaggio doppio che risulta nella reversione di sesso.
Il fatto che un gene capace di reprimere lo sviluppo del testicolo, quando presente in più copie, sia localizzato sul cromosoma X potrebbe suggerire che anche nei Mammiferi il dosaggio del cromosoma X possa aver avuto un ruolo nella determinazione del sesso. Nei Marsupiali alcuni aspetti dello sviluppo sessuale sembrano essere controllati dal rapporto tra cromosomi X ed autosomi, e ciò potrebbe far pensare che nei Mammiferi più meccanismi per la determinazione del sesso si siano sovrapposti nel corso dell'evoluzione: nei Mammiferi Euteri e nei Marsupiali, la determinazione del sesso si basa sulla presenza di un gene dominante, ma i Marsupiali hanno in parte conservato la dipendenza dal rapporto X/autosomi. L'esistenza del gene DSS sul cromosoma X sembra indicarci che un meccanismo basato sul rapporto X/autosomi potrebbe ancora esistere nei mammiferi, ma che su di esso l'evoluzione ha stratificato il nuovo sistema a gene dominante, mascherando il 'congegno' ormai vetusto con lo stratagemma dell'inattivazione del cromosoma X.
Dati recenti indicano che anche nel maschio XY l'unico cromosoma X viene inattivato in certi tipi cellulari durante lo sviluppo del testicolo, facendo sospettare che il ruolo dominante di Sry si possa espletare solo in assenza di interferenze da parte di geni localizzati sul cromosoma X.
L'esistenza di casi di reversione di sesso non dipendenti da mutazioni di SRY ha permesso di postulare l'esistenza del gene DSS, localizzato nella regione Xp21. In seguito, da questa regione è stato clonato un gene a cui è stato dato il nome di DAX1 (DSS-AHC critical region on the X, gene 1). Si ritiene che DAX1 si identifichi con il gene teorico DSS, e sia quindi responsabile della reversione di sesso dosaggio-dipendente. Benché nell'uomo mutazioni di questo gene provochino difetti nello sviluppo delle ghiandole surrenali (adrenal hypoplasia congenita, AHC), l'espressione di Dax1 nelle gonadi di topo è in favore del coinvolgimento di questo gene nella determinazione del sesso: Dax1 comicia a essere espresso a 11.5 dpc, e quindi in concomitanza con Sry; l'espressione continua nell'ovario, mentre termina a 12.0 dpc se la gonade bipotenziale si sviluppa in testicolo. Si pensa quindi che Dax1 svolga un ruolo chiave nel controllo della differenziazione dell'ovario
Dax1, come Sf1, codifica per un recettore nucleare ed entrambi i geni potrebbero far parte dello stesso sistema per il controllo dello sviluppo endocrino. I geni di questo tipo probabilmente agiscono in più stadi dello sviluppo embrionale. Al momento della divergenza dello sviluppo della gonade maschile da quella femminile, Dax1 potrebbe agire da iniziatore della via femminile, ma il meccanismo d'azione di questo gene nella determinazione del sesso non è ancora chiarito. Studi sulla superespressione di Dax1 in topi transgenici causano la reversione del sesso in topi XY, indicando un ruolo del gene della reversione del sesso sensibile alla dose. Tuttavia, a differenza dell'uomo, questo effetto dose si esprime solo in presenza di un allele Sry debole, mettendo in luce un inflenza modificatrice del background genetico sul gene murino.
Il clonaggio del gene DAX1 dal cromosoma X umano ha permesso anche di effettuare studi comparativi che potessero far luce sull'ipotizzato ruolo ancestrale di DSS in un meccanismo di determinazione del sesso basato sul rapporto X/autosomi, in parte conservato nei Marsupiali e nei Monotremi. In realtà in questi animali l'intero gruppo dei geni Xp umani, tra cui DAX1, si trova su un autosoma, ed è quindi poco probabile che tali geni facessero parte del cromosoma X ancestrale.
Nel dicembre 1998 (Nat.Genet.20 dicembre 1998 318-319;353-357) sono stati pubblicati i primi risultati sui topi knockout (portatori di un gene deleto) I risultati sono stati sorprendenti e se da una parte hanno chiarito la funzione di AHC nel topo (Ahch), dall'altra hanno aperto una serie di ulteriori interrogativi. Infatti il topo transgenico di sesso femminile non presenta compromissione ne dello sviluppo dell'ovaio ne di altri aspetti del differenziamento femminile, mentre il trangenico di sesso maschile non ha inversione sessuale, ma spermatogenesi alterata. Questi dati mettono in evidenza un'inaspettata funzione specifica del sesso maschile di questo gene. Questi risultati potrebbero riflettere una differenza fra l'uomo e il topo nel differenziamento sessuale come pure, piu verosimilmente, indicare una errata interpretazione del ruolo di AHC nella determinazione del sesso.
Il coinvolgimento di AHC nel differenziamento sessuale femminile derivava dall'osservazione sia che nell'uomo la duplicazione della regione dove AHC mappa, provoca reversione del sesso nei maschi le sia che nel topo l'espressione di Ahch e' aumentata nell'ovaio nel periodo del differenziamento sessuale. Va ricordato che l'insufficienza surrenalica nell'uomo deriva dal mancato sviluppo delle aree produttrici di ormoni steroidei nel surrene. Alla puberta' gli affetti mostrano una ridotta funzionalita' gonadica legata a difetti sia dell'ipotalamo che dell'ipofisi che compromettono la produzione di gonadotropine.
Un'analisi delle gonadi del topo XY mutante ha messo in evidenza un ridotto peso del testicolo. I testicoli appaiono normali alla nascita, ma successivamente vanno incontro a disgenesia e a riduzione delle cellule germinali fino alla completa perdita delle stesse. Questa degenerazione, provoca infertilita' e puo' essere originata da un alterato funzionamento delle cellule del Sertoli, che esprimono il gene Ahch e hanno funzione di sostegno nella spermatogenesi. Al contrario l'ipogonadismo nell'uomo sembra essere originato dalla mancanza di gonadotrpine ipofisarie. Nel topo mutante XX non ci sono alterazioni ne' riduzione della fertilita': sono presenti solo piccole alterazioni della struttura dei follicoli che possono indicare un ridotto funzionamento delle cellule della granulosa dovuto alla mancanza di Ahch.
La spiegazione della differenza fra atteso ed osservato puo' dipendere da due diversi motivi.
1)L'allele mutante codifica una proteina con una attivita' residua. Infatti, sebbene l'allele mutante manchi del secondo esone (essenziale per la funzione nell'uomo), e' ancora in grado di produrre trascritti per la maggior parte della proteina Ahch. Questi trascritti alterati tuttavia, sono presenti a livelli molto bassi, suggerendo che difficilmente la proteina possa avere attivita' a livelli significativi.
2) In alternativa la differenza fra il fenotipo umano e il topo knockout puo' indicare differenze specie-specifiche a livello di altri geni coinvolti nel differenziamento del sistema endocrino.
Il topo mutante sara' percio' uno ottimo strumento per la comprensione dei meccanismi che controllano lo sviluppo e la funzione del surrene e delle gonadi. Questo studio ha dimostrato che Ahch codifica sia per un fattore antitesticolo (che agisce negli stadi critici della determinazione del sesso) che per un fattore essenziale nella spermatogenesi. Rimane ancora da chiarire il ruolo di AHCH nell'uomo, mentre e' evidente che il gene dello sviluppo dell'ovaio e' ancora da trovare.

SOX3
Un gene che invece si trova nella regione del cromosoma X che si pensa essere comune a tutti i mammiferi è Sox3, il gene della famiglia SOX che presenta maggiore omologia con Sry. Si ipotizza che Sox3 fosse presente sia sul cromosoma X che su quello Y, ma che l'allele sul cromosoma Y, una volta isolato a causa dell'impossibilità di ricombinazioni, si sia rapidamente evoluto in Sry. Poiché tutte le proteine SOX riconoscono le stesse sequenze bersaglio sul DNA in vitro, è stato ipotizzato che SRY e SOX3 possano competere anche in vivo. L'evoluzione di Sry potrebbe perciò aver portato all'acquisizione della capacità di determinare il sesso maschile in quanto la proteina SRY, sufficientemente diversa da SOX3, competerebbe con successo per un sito bersaglio sul DNA, impedendo a SOX3 di attivare la via per lo sviluppo femminile.
Nell'embrione, Sox3 è espresso nel tessuto neurale e nelle cellule somatiche delle gonadi in entrambi i sessi. Nell'uomo, mutazioni di questo gene sono associate a ritardo mentale (X-linked mental retardation syndrome), ma i portatori (maschi) non mostrano alcuna disgenesia dei testicoli. Ampie delezioni della regione del cromosoma X che contiene SOX3 (Xq26-27) sono invece associate con la precoce regressione delle ovaie, ma non ci sono elementi sufficienti per identificare SOX3 come il gene responsabile dello sviluppo delle gonadi femminili. Futuri studi sulla superespressione di Sox3 in topi transgenici o sull'effetto di mutazioni Sox3-/- permetteranno forse di far luce sul ruolo svolto da questo gene nella determinazione del sesso.

WT1
La sindrome di Danish-Drash (DDS, Danish-Drash syndrome) e la sindrome di Frasier sono entrambe caratterizzate da difetti dello sviluppo dell'apparato urogenitale ed associate a mutazioni del gene del tumore di Wilms WT1, localizzato sul cromosoma 11. In pazienti affetti da DDS sono state individuate: -sostituzioni amminoacidiche che alterano i siti di contatto della proteina con il DNA; -terminazioni premature della traduzione; -mutazioni di siti di splicing. In tutti i casi osservati le mutazioni sono in eterozigosi, suggerendo un effetto dosaggio o una dominanza negativa della proteina mutata.
La sindrome di Frasier, come la DDS, è caratterizzata da un ampio spettro di alterazioni a carico dell'apparato urogenitale, tra cui disgenesia delle gonadi e, tra le persone affette, si osserva un'elevata incidenza di gonadoblastoma.

DMT1
Recentemente è stato isolato un altro gene umano espresso solo nel testicolo. Questo gene presenta una regione di legame con il DNA ed è stato chiamato DMT1 (DNA-binding motif gene 1- testis). DMT1 è localizzato sul braccio corto del cromosoma 9, in una regione interessata da mutazioni associate a reversione del sesso. Questo dato, insieme all'espressione limitata al testicolo, suggerisce che DMT1 sia un ulteriore membro della serie di geni coinvolti nel processo di determinzaione del fenotipo sessuale.

La biologia cellulare dello sviluppo del testicolo
Le gonadi si sviluppano a partire da una struttura primordiale comune agli embrioni sia di sesso maschile che di sesso femminile. Ad un certo stadio dello sviluppo dell'embrione, se non si ha l'espressione del gene Sry, la gonade indifferenziata comincia a svilupparsi come ovario; viceversa, se è presente un cromosoma Y, l'espressione di Sry in un preciso e critico momento dello sviluppo embrionale induce lo sviluppo del testicolo. Quindi il gene Sry è l'agente primario nella determinazione del sesso dei Mammiferi.
Subito dopo l'espressione di Sry, la gonade cresce di dimensioni e le cellule si riorganizzano formando strutture simili a cordoni, come dettagliatamente descritto; pertanto si potrebbe pensare che Sry agisca primariamente sull'architettura della gonade.
Già nella gonade indifferenziata (11.5 dpc nel topo) sono distinguibili le due principali linee somatiche: le cellule di supporto, che si differenzieranno in cellule di Sertoli nel maschio ed in cellule follicolari nella femmina, e le cellule steroidogeniche, che daranno le cellule di Leydig nel mashio e le cellule della teca nella femmina. Studi condotti con chimere XX-XY hanno consentito di stabilire che Sry è richiesto solo nelle cellule pre-Sertoli della gonade embrionale : si ipotizza che Sry determini il destino delle cellule pre-Sertoli, che a loro volta influenzano gli altri tipi cellulari del testicolo in sviluppo mediante interazioni intercellulari, dando inizio ai processi di riorganizzazione cellulare quali l'associazione e il movimento delle cellule, nonché la vascolarizzazione. Infatti la riorganizzazione morfologica della gonade è osservabile 12-24 ore dopo il picco di espressione di Sry. Probabilmente il completo differenziamento delle cellule di Sertoli è a sua volta raggiunto grazie a tale riorganizzazione strutturale, e quindi si creerebbero relazioni di interdipendenza tra i vari tipi cellulari, tutte finalizzate al raggiungimento della struttura definitiva del testicolo e all'acquisizione del fenotipo differenziato delle sue cellule somatiche. Le cellule di Sertoli e quelle di Leydig si distinguono chiaramente tra loro solo dopo la formazione dei cordoni cellulari, quando le cellule di Sertoli si aggregano all'interno dei cordoni e quelle di Leydig si localizzano negli interstizi.
Si pensa invece che le cellule germinali non abbiano alcun ruolo nel determinare la struttura del testicolo, in quanto in mutanti privi di di cellule germinali il testicolo si forma normalmente (al contrario nelle femmine le cellule germinali sono necessarie per mantenere la struttura follicolare dell'ovaio ).
Un terzo tipo di cellule somatiche presente nel testicolo è rappresentato dalle cellule connettivali, fra cui le cellule mioidi peritubulari: esse circondano i cordoni cellulari del testicolo, separando le cellule di Sertoli da quelle di Leydig. Esperimenti di organo-cultura suggeriscono che nel topo le cellule mioidi derivino da una popolazione di cellule che migrano nella cresta genitale dal mesonefro dopo 11.5 dpc. La migrazione cellulare dal mesonefro alla gonade è un processo specifico dello sviluppo della gonade maschile, dipendente dall'attività di Sry nella cresta genitale. La migrazione può essere indotta anche in una gonade femminile, ponendola a contatto con una porzione di tessuto di gonade maschile, e ciò dimostra che il tessuto maschile può esercitare un segnale chemiotattico attivo. Quando si induce la migrazione di cellule mesonefriche in una gonade femminile, si induce anche l'organizzazione dei cordoni tipici del testicolo.
Le cellule interessate alla migrazione sembrano essere associate ai vasi sanguigni, con significato non chiarito. Probabilmente per lo sviluppo del testicolo è necessario che la vascolarizzazione sia pienamente funzionante ad uno stadio più precoce di quanto richiesto per lo sviluppo dell'ovario. Infatti la gonade maschile cresce più rapidamente, ed ha quindi un fabbisogno di ossigeno maggiore. Un'altra possibilità è che la vascolarizzazione precoce del testicolo sia finalizzata ad esportare il testosterone e l'AMH necessari per la mascolinizzazione dell'embrione; per contro l'embrione femminile non avrebbe questa necessità perchè il suo sviluppo non è strettamente dipendente dagli estrogeni prodotti dalle gonadi embrionali.
Nel testicolo dell'adulto le cellule mioidi peritubulari sono associate alle cellule di Sertoli e partecipano alla formazione dei cordoni testicolari. Probabilmente l'arrivo di queste cellule nella gonade promuove l'ulteriore e definitiva differenziazione delle cellule pre-Sertoli e degli altri tipi cellulari già presenti nella gonade.

CONCLUSIONI

Le cellule pre-Sertoli della cresta genitale sono le uniche in cui è necessaria la presenza del cromosoma Y perché la gonade bipotenziale si sviluppi in testicolo, e si ritiene pertanto che il gene SRY si esprima in queste cellule. Questo significa che le cellule pre-Sertoli sono in grado di inviare segnali alle altre cellule della gonade inducendone la differenziazione. Un gene candidato quale bersaglio della segnalazione intercellulare di SRY è SOX9. Il fatto che SOX9 influenzi lo sviluppo delle ossa e delle cartilagini lascia supporre che esso sia espresso da cellule mesenchimali. Si può quindi ipotizzare che il suo ruolo nello sviluppo del testicolo sia legato all'espressione nelle cellule mesenchimali del mesonefro: queste cellule sono infatti interessate ad un processo di migrazione verso la gonade, necessario per la formazione dei cordoni sessuali del testicolo. Le mutazioni in Sox9, causando aploinsufficienza della proteina, comprometterebbero la capacità di tali cellule di rispondere al segnale chemioattrattivo, determinando il mancato sviluppo dei cordoni sessuali, che è il primo passo dell'organogenesi del testicolo.
I dati sul diretto coinvolgimento del gene DAX1 nella determinazione del sesso sono meno chiari. Questo gene è implicato più in generale nel controllo dello sviluppo endocrino e. pertanto, per far piena luce sulla sua funzione nel controllo dello sviluppo dei caratteri sessuali, non si può prescindere dalla comprensione delle interrelazioni tra ipofisi, ipotalamo, ghiandole surrenali e gonadi durante lo sviluppo embrionale. L'aspetto più interessante rimane la possibilità che DAX1, localizzato sul cromosoma X, possa rappresentare un elemento di un meccanismo ancestrale della determinazione del sesso basato sul dosaggio del cromosoma X.
L'ipotesi più diffusa è che la proteina SRY agisca direttamente come attivatore degli altri geni responsabili della formazione del testicolo. Recentemente è stato invece proposto che l'azione di SRY sia indiretta e mediata dai geni SOX3 e SOX9. Graves propone che il gene responsabile dell'attivazione del programma di organogenesi del testicolo sia SOX9: nelle femmine la proteina SOX3 inibirebbe l'azione di SOX9, impedendo la formazione del testicolo e lasciando quindi che si realizzi il programma predefinito di formazione dell'ovario; nei maschi, invece, SRY inibirebbe SOX3 permettendo a SOX9 di svolgere la sua funzione. Inoltre, l'attuale sistema a gene dominante avrebbe sostituito un precedente sistema di determinazione del sesso basato sul dosaggio di SOX3, e sarebbe il risultato dell'evoluzione di SRY a partire da SOX3.
L'interpretazione della complessa rete genetica che è alla base della determinazione del sesso richiede la comprensione della natura dinamica dello sviluppo embrionale, incentrata su meccanismi di induzione e risposta che si attivano in maniera transiente. Il controllo dello sviluppo in senso maschile o femminile è un sistema fortemente canalizzato: una volta che la decisione di iniziare lo sviluppo del testicolo è presa, tutte le cellule della gonade primordiale sono 'reclutate', con un meccanismo finemente controllato che rende molto rara l'evenienza di un ovotestis nei mammiferi.
I progressi compiuti in questi ultimi anni nell'identificazione dei geni coinvolti nella determinazione del sesso nei mammiferi lasciano solo intravedere la complessità dello sviluppo degli apparati riproduttivi. La comprensione del meccanismo d'azione dei geni che governano la differenziazione e lo sviluppo embrionale resta forse la sfida più affascinante della genetica molecolare, quella che ci permetterà di capire come nasce l'uomo.

 Ipotesi di interazione fra i geni coinvolti nel differenziamento sessuale formulata nel 1996. Dati successivi hanno chiarito il ruolo di DSS(AHCH).
(c.f.r. i lavori su AHCH successivi)