DNA RIPETUTO; DNA ALFOIDE e CENTROMERI
DNA ALTAMENTE RIPETITIVO
Il DNA altamente ripetitivo e' costituito da una serie di sequenze
molto brevi ripetute numerose volte in tandem, organizzate in
blocchi. La ripetizione in tandem di una breve sequenza crea delle
proprieta' fisiche particolari che possono essere sfruttate per
l'isolamento. Infatti spesso la sequenza ripetitiva ha una composizione
in basi che non rispecchia la composizione media del genoma e
quindi le permette di formare una frazione separata per densita'
di galleggiamento. A questo proposito e' utile dire che la densita'
di galleggiamento di un DNA duplex (d) dipende dal suo contenuto
in basi G-C ed e' espressa dalla seguente formula:
d=1,660+0,00098(%GC)gxcm-3.
Questa densita' si determina centrifugando il DNA in un gradiente
di densita' di cloruro di cesio (CsCl). In questo modo il DNA
forma una banda in corrispondenza della sua densita'. Le frazioni
di DNA che differiscono nella densita' di galleggiamento possono
cosi' essere separate su gradiente: una differenza di d di circa
0,005gxcm-3 e' sufficiente a separare due frazioni di DNA. Poiche'
d dipende dal contenuto in GC, una differenza di d di 0,005 corrisponde
a una differenza di contenuto GC del 5%.
Centrifugando un DNA eucariotico in gradiente di densita', esso
forma una serie continua di frammenti che vengono visualizzati
da un picco di assorbimento abbastanza ampio, centrato sul valore
di d che corrisponde al contenuto medio di GC del genoma. Questo
picco e' detto BANDA PRINCIPALE. Si osservano anche uno o piu'
picchi minori e questo materiale e' detto DNA SATELLITE. Ad esempio,
centrifugando in gradiente di densita' il DNA di topo, la banda
principale corrispondente al 92% del genoma ha una d di 1,701gxcm-3
che corrisponde a un contenuto medio di GC di 42% (tipico dei
mammiferi). Il picco minore corrisponde all'8% del genoma e ha
una d di 1,690gxcm-3. Esso corrisponde al DNA satellite del topo
che ha un contenuto in GC minore (30%).
I satelliti sono presenti in molti genomi eucarioti, rappresentano
il 5% dell'intero genoma e possono essere piu' pesanti o piu'
leggeri della banda principale. Infatti quando si determina la
composizione in basi di un satellite, si vede che essa e' spesso
diversa da quanto predetto in base alla d perche' essa dipende
anche da altri fattori come la composizione delle coppie di basi
piu' vicine e il grado di metilazione.
Centrifugando il DNA umano in gradiente di cloruro di cesio e
addizionando al gradiente buffers che si intercalano al DNA come
etidio bromuro, actinomicina o metalli che si legano ad esso (i
quali fanno aumentare il numero di satelliti) risultano 4 picchi
di cui:
il SATELLITE I con d=1,687gxcm-3
il SATELLITE II con d=1,693gxcm-3
il SATELLITE III con d=1,696gxcm-3
il SATELLITE IV con d=1,700gxcm-3
Il totale di questa frazione di DNA corrisponde al 6% del genoma.
Mediante ibridazione di questo DNA satellite su cromosomi umani
in metafase si e' visto che esso e' localizzato nell'eterocromatina
costitutiva delle regioni centromeriche. Infatti quando un cromosoma
viene colorato con composti che reagiscono col DNA, come il reattivo
di Feulgen, si distinguono regioni con diverse caratteristiche.
Le regioni densamente colorate sono dette ETEROCROMATINA, quelle
debolmente colorate vengono dette EUCROMATINA. Cio' riflette il
livello di compattezza del DNA nei cromosomi. L'eterocromatina
si distingue in COSTITUTIVA e FACOLTATIVA.
Un esempio di eterocromatina facoltativa e' costituito dal cromosoma
X inattivo, che si presenta eteropicnotico nei tessuti somatici
e costituisce il cosiddetto CORPO DI BARR o CROMATINA SESSUALE.
L'eterocromatina costitutiva e' localizzata a livello di regioni
pericentromeriche dei cromosomi umani, a livello di regioni telomeriche
e anche lungo i bracci dei cromosomi (come il cromosoma Y) e consiste
di DNA satellite.
E' opportuno a tale riguardo trattare della struttura e delle
funzioni del centromero.
CENTROMERO
Nei cromosomi dei mammiferi, uomo compreso, da studi citologici
in metafase, esso appare essere costituito da una COSTRIZIONE
PRIMARIA, che forma una specie di strozzatura laddove i due cromatidi
fratelli sono uniti. Concettualmente e' bene fare distinzione
tra il CENTROMERO, che e' parte integrante del cromosoma, e il
CINETOCORE, che e' una struttura esterna al cromosoma e che consiste
di proteine a funzione specifica complessate col DNA centromerico.
E' qui che si attaccano le fibre del fuso mitotico o meiotico.
Quindi il cinetocore e' funzionalmente e strutturalmente la porzione
del centromero responsabile della segregazione dei cromosomi nelle
cellule figlie durante la mitosi e la meiosi.
Al microscopio elettronico il cinetocore appare come una struttura
trilaminare, allineata parallelamente su entrambi i lati della
costrizione primaria. Su alcuni preparati sono state addirittura
visualizzati una dozzina circa di microtubuli del fuso che terminano
in corrispondenza della porzione piu' esterna del cinetocore.
L'intero centromero puo' essere diviso in tre domini: in porzione
piu' esterna il DOMINIO DEL CINETOCORE, un DOMINIO CENTRALE costituito
da eterocromatina centromerica e un DOMINIO INTERNO dove i cromatidi
fratelli sono in contatto.
Sono state identificate diverse e specifiche proteine centromeriche
(CENPs).
La CENP-A (17-19 KDa) e' una proteina istonica specifica per il
centromero. E' prodotta da un unico gene. Non si sa ancora che
cosa rende la cenp-A specifica per il centromero e a quali sequenze
di DNA si lega.
La CENP-B (80 KDa) e' stata caratterizzata piu' in dettaglio e
si trova in corrispondenza del dominio centrale di eterocromatina.
Studi in vivo e in vitro hanno mostrato che essa interagisce direttamente
con la classe di DNA della regione centromerica dei cromosomi
dei primati: l'ALFA SATELLITE. E' stato ipotizzato un suo ruolo
nel determinare lo stato di attivita' di un centromero, ma si
e' visto che e' presente anche inima il cinetocore cattura le
estremita' crescenti (plus) dei microtubuli; dopo di cio' questi
ultimi possono continuare ad aggiungere o sottrarre subunita'
di tubulina al cinetocore fungendo da "motore" che guida
il movimento dei cromosomi lungo le fibre del fuso. Esso genera
forze dirette in opposte direzioni: una verso le estremita' crescenti
(plus) durante la disposizione dei cromosomi nella zona equatoriale
in prometafase, una verso le estremita' eine per la porzione piu'
interna del centromero e CLIPs che sono proteine che legano i
cromatidi, in modo perpendicolare all'asse longitudinale del cromosoma.
Oltre alle funzioni di tenere uniti i cromatidi fratelli e di
interagire con le fibre del fuso mitotico o meiotico, una terza
funzione del centromero e' quella di partecipare, attraverso l'azione
del cinetocore, al movimento dei cromosomi verso i poli del fuso
in anafase. Dapprima il cinetocore cattura le estremita' crescenti
(plus) dei microtubuli; dopo di cio' questi ultimi possono continuare
ad aggiungere o sottrarre subunita' di tubulina al cinetocore
fungendo da "motore" che guida il movimento dei cromosomi
lungo le fibre del fuso. Esso genera forze dirette in opposte
direzioni: una verso le estremita' crescenti (plus) durante la
disposizione dei cromosomi nella zona equatoriale in prometafase,
una verso le estremita' dei poli (minus) durante il movimento
cromosomico verso i poli opposti in anafase. Questo "motore"
puo' essere localizzato nella corona fibrosa che si trova in posizione
adiacente alla zona piu' esterna del
cinetocore.
DNA SATELLITE
Le famiglie di DNA satellite nei diversi ordini di mammiferi,
come roditori e primati, non sembrano essere in relazione considerando
le loro sequenze. Tuttavia, somiglianze di organizzazione cromosomale
e di brevi sequenze coinvolte nel riconoscimento di proteine centromeriche
fanno pensare a un coinvolgimento dei DNA satellite nel definire
la struttura e la funzione dei centromeri.
Il primo DNA satellite ad essere isolato e' stato il DNA satellite
maggiore del topo. Esso e' localizzato al di fuori della regione
che comprende la costrizione primaria dei cromosomi in metafase,
ma e' comunque coinvolto nelle funzioni del centromero in quanto
una sua digestione distrugge il legame dei cromatidi fratelli.
In seguito fu isolato il DNA satellite minore di topo. Esso consiste
di una ripetizione in tandem di una sequenza di 120bp. Nella regione
centromerica del genoma umano e' presente l'alfa satellite.
ALFA SATELLITE o DNA ALFOIDE
La famiglia di DNA alfa satellite consiste di monomeri ripetuti
in tandem, ognuno dei quali e' approssimativamente lungo 171bp.
Esso e' localizzato nell'eterocromatina centromerica. Blocchi
di alfa satellite, costituiti da monomeri divergenti di alfoidi,
possono estendersi per diversi milioni di paia di basi nella regione
centromerica di ogni cromosoma.
Oltre a questo PRIMO ORDINE DI RIPETIZIONE (monomeri di 171bp)
il DNA alfoide presenta in genere un SECONDO ORDINE DI RIPETIZIONE,
formato da blocchi identici di monomeri, come da schema seguente:
ove n indica il numero di monomeri che in toto costituiscono un
blocco a PIU' ALTO ORDINE DI RIPETIZIONE (higher order repeat
unit). I singoli monomeri che costituiscono un PIU' ALTO ORDINE
DI RIPETIZIONE hanno una omologia di sequenza intorno al 70%.
Invece un monomero di un blocco si presenta praticamente identico
al monomero corrispondente degli altri blocchi che costituiscono
il PIU' ALTO ORDINE DI RIPETIZIONE. E1 ed E2 rappresentano degli
ipotetici enzimi di restrizione che tagliano costantemente nell'unita'
di ripetizione.
Questo modello e' valido per l'organizzazione dei diversi alfoidi
dei cromosomi umani. Ad es. per quanto riguarda il cromosoma X
l'unita' ripetuta consiste di 12 monomeri disposti in tandem,
come rivelato operativamente dall'enzima di restrizione BamHI,
che taglia ogni 2.0kb (=12n). Questi frammenti di 2.0kb sono ripetuti
5.000 volte circa nel cromosoma X.
Le differenze di sequenza fra alfoidi di cromosomi diversi sono
sufficienti a dare ad una sequenza alfoide una alta specificita'
per il cromosoma da cui deriva.
FAMIGLIE DI SEQUENZE DI DNA ALFOIDE
Come detto, Il DNA alfoide e' costituito da sequenze di DNA
ripetuto in tandem organizzato in monomeri di 171bp. Inizialmente
furono caratterizzati nel genoma umano frammenti di DNA di 340bp
tagliati dall'enzima di restrizione EcoRI. Essi consistono di
due copie di DNA alfoide disposte in tandem rispettivamente di
169 e 171bp con una divergenza di sequenza del 27%. Questi dimeri
sembrano costituire la subunita' base di unita' di sequenze alfoidi
piu' lunghe ripetute in tandem. Dal clonaggio di vari membri di
unita' dimeriche e tetrameriche EcoRI e' emersa una divergenza
che va dal 13-20% per unita' distinte di dimeri fino al 45% per
subunita' di monomeri adiacenti. Tetrameri alfoidi ottenuti dalla
restrizione con l'enzima XbaI hanno una divergenza del 21% dal
tetramero EcoRI. Ogni cromosoma contiene per lo meno una specifica
struttura alfoide, spesso specificata da un sito di restrizione
cromosoma-specifico. Famiglie di DNA alfoide cromosoma specifiche
possono essere raggruppate in tre famiglie di ordine superiore,
alle quali appartengono distinti gruppi di cromosomi.
Sono state descritte e isolate diverse sequenze che contengono
DNA alfoide. La loro localizzazione cromosomica e' stata determinata
mediante ibridazione in situ. Tutte le sequenze ibridano soltanto
nella regione pericentromerica. In condizioni di alta stringenza
ogni sequenza ibrida esclusivamente con un solo paio di cromosomi
omologhi. In condizioni di bassa stringenza ogni sequenza ibrida
in maniera intensa nella regione pericentromerica di diversi cromosomi
e con meno intensita' ibrida su tutti gli altri. Sulla base di
cio' sono stati definiti tre gruppi di famiglie alfoidi (FAMIGLIE
SOPRACROMOSOMICHE).
Il GRUPPO 1 e' costituito da sequenze che ibridano piu' intensamente
con i cromosomi 1,3,5,6,7,10,12,16,19.
Il GRUPPO 2 e' costituito da sequenze che ibridano con i cromosomi
2,4,8,9,13,14,15,18,20,21,22.
Il GRUPPO 3 e' costituito da sequenze che ibridano con i cromosomi
11,17,X.
In condizioni non stringenti le sequenze dei gruppi 2 e 3 ibridano
corrispondentemente ai cromosomi dei gruppi 2 e 3 in modo piu'
intenso rispetto ai cromosomi del gruppo 1. L'unica eccezione
e' rappresentata dal cromosoma 1 che lega le sequenze del gruppo
3 piu' debolmente dei cromosomi 11,17,X, ma in modo piu' forte
di quanto non facciano gli altri cromosomi. Da questo si evince
che molto probabilmente il cromosoma contiene due tipi di sequenze
appartenenti al gruppo 1 e 3. L'esistenza di soprafamiglie cromosomiche
indica che famiglie alfoidi localizzate su cromosomi appartenenti
a un gruppo sono capaci di cross-ibridare intensamente tra di
loro, ma non con cromosomi appartenenti a gruppi diversi. Inoltre,
una sequenza alfoide specifica per il cromosoma 4 (pYAM11-31),
per esempio, ibrida piu' intensamente di ogni altra con i rimanenti
cromosomi del gruppo 2; invece sequenze specifiche per alcuni
cromosomi cross-ibridano molto debolmente con i cromosomi dello
stesso gruppo e questo accade per il gruppo 3. La conclusione
che sequenze alfoidi cromosoma-specifiche appartenenti a un gruppo
sono strettamente correlate e' derivata da esperimenti di ibridazione
di DNA genomico (digerito con diversi enzimi di restrizione) con
sonde corrispondenti ad alfoidi cromosoma-specifici. Infatti DNA
genomico digerito ad esempio con BamHI e ibridato con sonde di
alfoidi specifici per cromosomi appartenenti ai 3 gruppi mostra
2 particolarita':
1) Sequenze di gruppi diversi BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD
BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD presentare periodicita' di stessi
siti di restrizione.
CARATTERISTICHE DELLE FAMIGLIE DI DNA ALFOIDE
Le sequenze della FAMIGLIA SOPRACROMOSOMICA 1 sono caratterizzate
da siti EcoRI di 340bp periodicamente ripetuti. Le sequenze appartenenti
a questa famiglia presentano dimeri e tetrameri EcoRI. La famiglia
alfoide specifica per il cromosoma 7 consiste di ripetizioni di
dimeri EcoRI organizzati in unita' a piu' alto ordine di ripetizione
di 2.7Kb individuate dall'enzima di restrizione BamHI. La divergenza
tra dimeri contigui nell'unita' di 2.7Kb e' meno del 2%. Anche
la famiglia specifica per il cromosoma 10 presenta periodicita'
di dimeri EcoRI. Un'organizzazione diversa e' presente nel cromosoma
3. La sua unita' di ripetizione di 3Kb, individuata dall'enzima
di restrizione PstI, contiene frammenti EcoRI di 340bp, 510bp,
680bp. Il tetramero di 680bp potrebbe essersi generato per mutazione
in un sito di restrizione EcoRI, mentre il trimero di 510bp per
crossing-over ineguale tra 2 dimeri EcoRI.
Le sequenze della FAMIGLIA SOPRACROMOSOMICA 2 sono anch'esse caratterizzate
da siti EcoRI, ma la unita' di ripetizione piu' corta e' un tetramero
(680bp). Possono anche essere presenti doppi tetrameri (1360bp)
organizzati in unita' a piu' alto grado di ripetizione individuate
dall'enzima di restrizione PstI. Meno frequentemente si osservano
pentameri (850bp). I tetrameri risultano essere costituiti da
2 tipi di monomeri organizzati in 2 dimeri con 82% di omologia.
Le sequenze della FAMIGLIA SOPRACROMOSOMICA 3 sono caratterizzate
da 5 tipi di monomeri che sono condivisi da tutti e tre i cromosomi
appartenenti ad essa (11, 17, X). Anche il cromosoma 1, costituito
da due distinte famiglie di DNA alfoide, presenta i cinque tipi
di monomeri. La sequenza del cromosoma 11 e' quasi una perfetta
ripetizione dei pentameri alfoidi. Il cromosoma X e il cromosoma
17 sono formati rispettivamente da 12 e 16 monomeri. Nel cromosoma
X l'ordine monomerico della sequenza pentamerica ancestrale e'
stato conservato, mentre nel cromosoma 17 c'e' una triplicazione
del monomero 1 (vedi disegno).
E' stata trovata una nuova famiglia di DNA alfoide, la famiglia
XbaI, localizzata sui cromosomi 2,4,14,15,18,20,22 (tipici della
famiglia 2) che presenta la stessa configurazione a tetrameri
con 98% di omologia, composta da dimeri con 84% di omologia. Sono
stati fatti studi di comparazione dei monomeri della famiglia
XbaI con monomeri derivanti dai dimeri EcoRI e dai pentameri.
La sequenza consenso dei dimeri della famiglia XbaI manca di 28
basi che sono caratteristiche dei dimeri EcoRI e mostra 16 basi
che sono uniche per questa famiglia. Questi risultati dimostrano
che la famiglia XbaI e le sequenze EcoRI non derivano dalla stessa
unita' dimerica alfoide e, nonostante abbiano la stessa organizzazione
dimerica, rappresentano 2 distinte subfamiglie alfoidi. Gli stessi
risultati si sono ottenuti dal confronto di monomeri XbaI con
monomeri derivanti dall'alfoide specifico del cromosoma 17 e appartenenti
a unita' pentameriche.
RELAZIONI FRA FAMIGLIE CROMOSOMA SPECIFICHE DI DNA ALFOIDE
Da tutte queste considerazioni e' possibile notare 3 tipi di
periodicita':
1) Il monomero alfoide e' comune a tutte le famiglie sopracromosomiche;
2) Le ripetizioni ancestrali sono comuni a tutte le sequenze di
una famiglia sopracromosomica;
3) Le unita' a piu' alto ordine di ripetizione sono uniche per
ogni cromosoma.
Inoltre la sequenza ancestrale della famiglia sopracromosomica
1 era formata da identiche unita' dimeriche EcoRI di 340bp; la
sequenza ancestrale della famiglia sopracromosomica 2 aveva una
struttura dimerica divergente ed era probabilmente organizzata
in tetrameri; la sequenza ancestrale della famiglia 3 era formata
da identici pentameri.
Nelle famiglie sopracromosomiche 1 e 3 il grado di divergenza
tra ripetizioni ancestrali in varie famiglie cromosoma-specifiche
va dall'1-2% (per i cromosomi 11 e 17) al 15-20% (per i cromosomi
3 e X). Inoltre le sequenze di un gruppo sopracromosomico sono
anche correlate l'un l'altra a diversi gradi. Le sequenze altamente
specifiche non hanno copie strettamente correlate, ma quelle meno
specifiche possono formare distinte subfamiglie nel loro gruppo.
Le divergenze tra gruppi non sono neanche uguali. Infatti le famiglie
sopracromosomiche 2 e 3 sono piu' strettamente correlate tra loro
e meno correlate rispetto alla 1. Esse possono cosi' considerarsi
come 2 branche di una superfamiglia.
E' da notare inoltre che non ci sono sequenze alfoidi che cross-ibridano
col cromosoma Y. Percio' le sequenze Y specifiche di DNA satellite
si sono distinte dalla comune branca prima della formazione di
sequenze cromosoma-specifiche.
E' stata definita una sequenza consenso per l'alfa satellite
umano basata sull'analisi di piu' di 30 monomeri indipendenti
trovati in almeno 14 cromosomi umani. Essa e' utilizzata per comparare
nuove sequenze alfoidi, per identificare possibili elementi con
sequenze conservate, e per esaminare variazione di sequenze in
elementi presenti nello stesso cromosoma o in cromosomi diversi.
Si e' potuto cosi' osservare che la divergenza del 15-20% nella
sequenza di monomeri rispetto alla sequenza consenso non e' distribuita
a caso, ma e' presente in monomeri appartenenti allo stesso cromosoma
o che hanno una comune evoluzione. Ad esempio, mentre solo il
10% circa di tutti i monomeri di un genoma contiene una G in posizione
9 della sequenza consenso, tutti i monomeri sequenziati del cromosoma
Y la contengono.
Inoltre solo il 19% di tutti i monomeri contengono una A in posizione
28 e per la maggior parte questi appartengono a un gruppo di monomeri
che pare abbiano una comune evoluzione e che riguardano i cromosomi
1, 11, 17 e X.
SEQUENZA p82H DI DNA ALFOIDE
In contrasto con la distribuzione cromosoma specifica di sequenze
alfoidi, e' stato isolato un clone (p82H) che cross-ibrida, a
bassa stringenza, con quasi tutti i cromosomi umani. Il clone
p82H corrisponde ad una regione di 2.4Kb contenuta in un dominio
genomico di 35Kb circa. Questo dominio si trova esclusivamente
nella regione centromerica del cromosoma 14. Da risultati di ibridazione
in situ, si e' dedotto che p82H rappresenta una famiglia conservata
di DNA alfoide, detta famiglia 82H, localizzata su ogni cromosoma
umano. Essa puo' corrispondere a componenti funzionali dei centromeri
umani. Infatti e' stata evidenziata una omologia di sequenza nucleotidica
tra una regione di p82H e sequenze centromeriche funzionali di
lievito. La presenza di sequenze 82H fa supporre che esista anche
una classe piu' omogenea di DNA alfa satellite conservato nell'uomo.
Si sono fatti esperimenti di ibridazione di DNA genomico e DNA
di ibridi somatici contenenti uno o piu' cromosomi con la sequenza
p82H in condizioni di varia stringenza. Si e' visto che in condizioni
di stringenza bassa o moderata, p82H ibrida con la maggior parte
di sequenze genomiche, ma questi segnali di ibridazione scompaiono
in condizioni di alta stringenza. In questo caso p82H ibrida solo
con una banda di 4Kb tagliata con EcoRI localizzata sul cromosoma
14. Comunque, in condizioni di bassa e media stringenza, p82H
ibrida con frammenti corrispondenti a sequenze alfoidi specifiche
per alcuni cromosomi. Infatti essa ibrida con un frammento di
2Kb tagliato con HindIII specifico per il cromosoma X oppure con
un frammento di 2.7Kb tagliato con HaeIII specifico per il cromosoma
7. Questi risultati indicano che il probe p82H cross-ibrida con
sequenze alfoidi eterologhe in condizioni di bassa e media stringenza.
Inoltre le intensita' dei segnali di cross-ibridazione sono proporzionali
al numero di copie di unita' altamente ripetute di sequenze cromosoma-specifiche.
Ad es. il segnale sul cromosoma X (che ha 5000 copie dell'unita'
di 2Kb individuata da BamHI) e' piu' forte di quello sul cromosoma
7 (che ha 10 copie dell'unita' di 2.7Kb individuata da HaeIII).
Inoltre, in condizioni di bassa stringenza, il segnale di ibridazione
che corrisponde alle sequenze genomiche 82H (cioe' un frammento
di 4Kb prodotto da digestione di DNA genomico con EcoRI) e' meno
intenso di quello presente sul frammento di 2.7Kb corrispondente
al cromosoma 7. Questo indica che le sequenze 82H sono con molta
probabilita' poco rappresentate e presenti in singola copia o
in basso numero di copie nel genoma.
POSSIBILI MECCANISMI CHE CREANO E MANTENGONO LA SPECIFICITA' CROMOSOMALE
Abbiamo gia' detto in precedenza che ci sono sequenze alfoidi
cromosoma specifiche nel DNA alfa satellite. Questa disposizione
puo' essere dovuta a 2 processi principali:
1) Omogenizzazione inter e intracromosomica;.lm4
2) Trasferimenti di DNA intercromosomale accompagnato da multipli
eventi di amplificazione.
Il concetto di OMOGENIZZAZIONE (valido sia per famiglie di geni
che per sequenze non codificanti) fu introdotto per la prima volta
da Dover. Esso afferma che differenze tra famiglie cromosoma-specifiche
sono il risultato di recenti mutazioni che si sono omogenizzate
solo in quel particolare cromosoma (omogenizzazione intracromosomica).
La omogenizzazione intercromosomica, che agisce meno efficientemente
della prima, potrebbe portare a trasferimento di queste mutazioni
in altri cromosomi. E' possibile fare uno schema che mette in
evidenza il pattern cromosoma-specifico di variazione di sequenza
osservato nell'alfa satellite umano. Si considerino tre blocchi
in tandem su tre diversi cromosomi (A, B, C).
Copie di ripetizioni a piu' alto ordine in ogni blocco sono piu'
simili tra loro di quanto non lo siano con copie di ripetizioni
correlate su altri cromosomi. Cosi' ogni gruppo di alfa satellite
e' caratterizzato da scambi nella sequenza (che nella figura corrispondono
ai simboli geometrici) che sono specifici per i monomeri di un
cromosoma (vedi cromosoma A) o sono specifici per monomeri di
gruppi evoluzionalmente correlati (vedi cromosomi B e C). Le 3
copie del cromosoma A mostrate in figura rappresentano variazioni
in un blocco o in blocchi dello stesso gruppo su differenti copie
dello stesso cromosoma in una popolazione (determinando cosi'
delle varianti polimorfiche). Da questo schema si puo' dedurre
che ci sono 3 tipi di mutazioni che portano a omogenizzazione:
.LM 0.0"
1) Mutazioni recenti che sono condivise da una coppia di cromosomi;
2) Mutazioni piu' vecchie che sono condivise da una famiglia sopracromosomica;
3) Mutazioni ancora piu' vecchie che hanno omogenizzato nell'intero
genoma.
Una analisi attenta della struttura e delle unita' a piu' alto
grado di ripetizione rende possibile ricostruire la sequenza di
eventi evoluzionistici nelle famiglie sopracromosomiche e vedere
come queste unita' si siano generate da una singola singola ancestrale,
in base al concetto che ogni famiglia sopracromosomica e' il risultato
di una evoluzione di una semplice sequenza ancestrale. Col tempo
questa sequenza si e' modificata per mezzo di mutazioni e di crossing-over
ineguale. Cosi' unita' ancestrali contigue hanno iniziato a divergere.
Se un segmento contenente ripetizioni non identiche e' stato trasferito
ad altri cromosomi e ha subito qui processi di amplificazione,
si e' formata un'unita' a piu' alto grado di ripetizione. Questa
puo' a sua volta essere trasferita ripetutamente ad altri cromosomi
e subire amplificazioni di ordine superiore. La possibilita' che
un cromosoma possa partecipare a diversi trasferimenti e' bassa
ed e' ancor piu' bassa la probabilita' che due sequenze possano
essersi amplificate in uno stesso posto. E' vero che i cromosomi
contengono una sequenza alfoide specifica, ma talvolta ci possono
essere due o piu' domini specifici. Alcuni cromosomi, come il
cromosoma 1, contengono due domini cromosoma-specifici formati
da sequenze di due famiglie sopracromosomiche. Inoltre e' stato
notato che nel genoma coesistono sequenze che sono molto vicine
alla sequenza ancestrale e sequenze che divergono da essa. Una
risposta a cio' potrebbe essere data da una combinazione di schemi
di omogenizzazione e di trasferimenti/amplificazione. Si possono
presentare 2 possibilita':
1) E' possibile che una parte delle sequenze di una famiglia cromosoma-specifica
abbia subito omogenizzazione e che quindi diverga poco dalla sequenza
ancestrale, mentre l'altra parte abbia collezionato mutazioni
e che diverga maggiormente. Poi le sequenze divergenti, comparendo
su un altro cromosoma, possono subire amplificazione formando
una nuova famiglia cromosoma-specifica.
2) La sequenza tipica di una famiglia cromosoma-specifica e' trasferita
su un altro cromosoma ed e' qui che subisce amplificazione. In
questo caso due cromosomi avranno famiglie quasi identiche. Ogni
famiglia puo' poi subire una evoluzione cromosoma-specifica portando
alla formazione di 2 distinte famiglie cromosoma-specifiche.
La differenza tra le due possibilita' e' che nel primo caso le
mutazioni sono raccolte prima della secondaria amplificazione,
nel secondo caso si verificano dopo.
BASE MOLECOLARE DEI MECCANISMI DI VARIABILITA' NELLE FAMIGLIE DI DNA ALFOIDE
E' opportuno considerare questa variazione di sequenze nel
contesto di blocchi ripetuti sia su un singolo cromosoma sia tra
tutte le copie di un particolare cromosoma in una popolazione.
Cio' che si e' visto analizzando l'organizzazione dell'alfa satellite
usando probes di DNA specifici per diversi alfoidi e' l'alta presenza
di polimorfismi di DNA. Infatti e' possibile trovare nello stesso
blocco forme multiple di alfa satellite correlate tra di loro
ma distinguibili o per la lunghezza dell'unita' ripetitiva o per
l'esistenza di siti di restrizione specifici o per entrambi. Analizzando
l'alfa satellite del cromosoma 17 si e' evidenziata la presenza
contemporanea di distinte forme di ripetizioni in un singolo set
aploide. Queste forme differiscono o nella lunghezza dell'unita'
ripetitiva (variando da 13 a 16 monomeri) o nella sequenza nucleotidica.
Percio' questi polimorfismi di unita' ripetitive si sono estesi
nell'intero blocco. Sembra cosi' ragionevole proporre che alcune
di queste forme rappresentino dei passi intermedi nell'evoluzione
di un apparato piu' o meno omogeneo. Questi polimorfismi hanno
un enorme interesse sia da un punto di vista evoluzionistico sia
pratico. In virtu' della loro presenza nelle regioni centromeriche,
possono essere utili nell'analisi di non disgiunzioni di cromosomi
nell'uomo e possono fornire marcatori genetici polimorfici per
studi di fingerprinting.
E' stata anche investigata la base molecolare dei meccanismi di
variabilita' dell'alfa satellite. Esperimenti di Southern blot
sul satellite di topo, BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD BAD
BAD BAD BAD BAD BAD BAD naria, con il 40% di divergenza). I quarti
di ripetizione sono costituiti da due subunita' correlate (1/8
di ripetizione) e vengono indicati sequenze alfa e beta. La divergenza
fra gli ottavi di ripetizione e' del 61%. Le sequenze alfa hanno
tutte l'inserzione di una C e le sequenze beta hanno tutte un
trinucleotide rispetto alla sequenza consenso. All'interno della
sequenza di consenso si riconoscono 3 ripetizioni di 9bp. Quindi
la sequenza satellite attuale di topo si puo' ritenere come derivata
da una sequenza di 9bp:
Da queste osservazioni si e' ricostruita la possibile evoluzione
delle sequenze di DNA satellite. In diversi momenti una certa
ripetizione di basi si e' amplificata lateralmente generando un
gran numero di copie identiche in tandem. Questo evento e' detto
AMPLIFICAZIONE GENICA o REPLICAZIONE SALTATORIA. La divergenza
osservata fra le copie e' dovuta ad accumulo di mutazioni. E'
di seguito riportato come esempio uno schema di replicazione saltatoria
per una sequenza di 6 paia di basi (AATCCT).
La sequenza di 12bp puo' a sua volta dare replicazione saltatoria
e se ha accumulato mutazioni di vario genere come delezioni, mutazioni
puntiformi o inserzioni, la sequenza che ne risultera' si differenziera'
sempre piu' da quella originale di 6bp. Se si ha amplificazione
di una copia genica non mutata si ha una serie identica a quella
originale. In questo caso si verifica omogenizzazione.
Inoltre: quando il DNA di un genoma eucariotico e' digerito con
un enzima di restrizione, la maggior parte di esso da' una serie
di frammenti dovuti alla distribuzione casuale dei siti di taglio.
Il DNA satellite invece genera bande nette perche' si producono
una serie di frammenti di dimensione identica o quasi dovuti alla
presenza di siti di restrizione che giacciono a una distanza regolare
l'uno dall'altro. Questi frammenti dovrebbero corrispondere al
monomero base (n), ma dal taglio con enzimi di restrizione appropriati
si sono generati anche dimeri, trimeri, tetrameri e cosi' via
(2n, 3n, 4n). Questi frammenti sono prodotti quando un'unita'
ripetitiva ha perso il sito di restrizione in seguito a mutazione,
quindi l'enzima non riconoscera' piu' la sua palindrome specifica
e dara' frammenti multipli del monomero base. Un altro meccanismo
che porta da un lato alla variabilita' delle sequenze dell'alfa
satellite e dall'altro all'omogenizzazione e' dovuta a un CROSSING-OVER
ineguale. In una regione di DNA non ripetuto la ricombinazione
avviene tra punti corrispondenti di due cromosomi omologhi. Puo'
anche avvenire una ricombinazione ineguale quando si hanno copie
multiple di geni con esoni correlati che si appaiano scorrettamente.
La probabilita' che appaiamenti scorretti avvengano in un gruppo
di sequenze identiche o quasi, e ripetute in serie, e' molto piu'
alta. Se consideriamo una sequenza con unita' ripetitive AB su
un cromatide e ab sull'altro si potrebbero generare due allineamenti:
ALLINEAMENTO CORRETTO O IN REGISTRO e ALLINEAMENTO SCORRETTO o
FUORI REGISTRO.
Se avviene un evento di ricombinazione all'interno della regione
appaiata irregolarmente, i ricombinanti avranno un numero diverso
di unita' ripetitive: in un caso il gruppo e' piu' lungo, nell'altro
e' piu' corto. Se e' presente una mutazione la ricombinazione
avviene cosi' tra serie sfasate con perdita della mutazione nella
batteria piu' corta e una diffusione in quella piu' lunga. Cicli
successivi di scambi tra cromatidi fratelli possono:
1) espandere la batteria piu' corta ma perfetta fino alla lunghezza
originale (e dare omogenizzazione);
2) possono diffondere la mutazione attraverso la batteria piu'
lunga, con produzione di una nuova batteria in tandem che presenta
una sequenza leggermente diversa (e dare un polimorfismo).
In questo tipo di appaiamento scorretto le unita' ripetitive sono
allineate in REGISTRO, cioe' ogni ripetizione AB corrisponde a
una ripetizione ab. Se pero' i singoli componenti dell'unita'
ripetitiva sono ben correlati tanto da potersi appaiare, si dice
che i due gruppi si potrebbero allineare in 1/2 REGISTRO, con
la sequenza A di un gruppo con la b dell'altro. Naturalmente cio'
dipende dalla percentuale di omologia tra le due meta' dell'unita'
ripetitiva.
Nel gruppo superiore l'unita' AB e' sostituita da un'unita'
Aab; nel gruppo inferiore l'unita' ab e' sostituita da un'unita'
B. In questo modo si osservano, dopo digestione di alfa satellite,
unita' ripetitive con n+1/2n monomeri.
La ricombinazione ineguale e' stata proposta come modello alternativo
alla replicazione saltatoria per spiegare l'evoluzione degli alfa
satelliti. Inoltre il crossing-over ineguale avviene in siti casuali
e piu' eventi casuali potrebbero far espandere un'unita' ripetitiva
in tutto il satellite. Questo processo e' detto FISSAZIONE DEL
CROSSING-OVER. Se 1, 2, 3, 4, 5 sono unita' ripetitive strettamente
correlate tra loro si potrebbe verificare:
Tutti questi eventi di ricombinazione possono avvenire tra singoli
monomeri e tra unita' a piu' alto grado di ripetizione
Un terzo meccanismo che contribuisce al mantenimento dell'omogenizzazione
e alla variabilita' di sequenze ripetute e' la CONVERSIONE GENICA.
Data una serie di monomeri posti in tandem, una copia di un monomero
puo' appaiarsi con un monomero mutato formando un eteroduplex.
Un evento di scambio generera' una serie di monomeri che avra'
perso la mutazione. In seguito ad amplificazione si ripristinera'
la serie originale di monomeri. Inoltre si avra' anche una serie
di monomeri mutata che diffondera' la mutazione.